一、細胞復(fù)蘇

將凍存細胞從液氮中取出后，在37℃水浴鍋內(nèi)不斷搖動促進其融化。移人15ml離心管中，加入10ml預(yù)熱的DMEM完w全培養(yǎng)基，輕輕吹勻，離心，2000rpmX2min，棄上清液。

加入10mlDMEM培養(yǎng)基清洗，棄上清液。加入10mlDMEM完w全培養(yǎng)基，輕輕吹打，接種于10cm盤中，在含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

二、細胞傳代

細胞密度達到80%~90%時．去培養(yǎng)基，10mlPBS清洗2次。加入3ml含0．25%EDTA的胰y蛋白酶，放人細胞培養(yǎng)箱3min。加人1mlDMEM完w全培養(yǎng)基終止胰y酶消化，轉(zhuǎn)移至15ml離心管。

加入10mlPBS清洗細胞培養(yǎng)盤，轉(zhuǎn)移至15ml離心管，2000rpmX2min，棄上清液。再加入10mlPBS（經(jīng)高壓滅菌，保存于40C），吹勻，吸取10微升進行計數(shù)，按照1×106/盤接種，在含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

三、細胞凍存

細胞密度達到80%～90%時，去培養(yǎng)基，10mlPBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰y蛋白酶，放人細胞培養(yǎng)箱3min。加入lmlDMEM完w全培養(yǎng)基終止胰y酶消化，轉(zhuǎn)移至15ml離心管。加入10mlPBS清洗細胞培養(yǎng)盤，轉(zhuǎn)移至15ml離心管，2000rpmX2min，棄上清液。

加入lml凍存液（90%血清，10%DMSO），放入凍存盒內(nèi)（盒內(nèi)有異丙醇，以保證溫度降低的速度），立即放入一80℃冰箱內(nèi)，過夜，第二天放入液氮中，可以保存至少兩年，如不放人液氮，可以保存三個月。

凍存液的配制：70%的完w全培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，邊滴邊搖。

進入細胞間開始細胞培養(yǎng)時，必須嚴(yán)格按照下列步驟操作：

①確定所有的細胞操作用的溶液和耗材都已經(jīng)消毒并檢測沒有問題，不確定的溶液和耗材請勿使用，除非特殊情況，不要借用別人的溶液。

②確定衣服的袖口已經(jīng)卷起或者白大褂的袖口已經(jīng)扎緊。

③確定酒精燈內(nèi)的酒精量，需要的話及時進行補充。

④確定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。為了方便單手開啟瓶蓋，實驗開始前可以把所有瓶蓋旋松。

⑤盡量不要直接傾倒溶液，除非瓶口沒有被燒壞。如果傾倒失敗，溶液粘在瓶口，請用噴過75%酒精的紙巾仔細清潔瓶口周圍（不要接觸到瓶口）后在火焰上簡單燒灼。

⑥操作時如果不能肯定所用的耗材是潔凈的，必須及時更換。

⑦實驗完畢及時收拾，保持工作區(qū)域清潔整齊，最后用75%酒精清潔臺面。